Monoflorale honing

Datum: Mei 2017

Principe:

Als honing monofloraal is dan mag men verwachten dat er voornamelijk een type stuifmeel inzit. Dat kan men microscopisch controleren.

Materiaal:

  • Microscoop (bij voorkeur ook met donkerveld)
  • Microscoopcamera's
  • Objectglaasjes
  • Dekglaasjes
  • Spatel
  • Water
  • Microscoop prepareerset (pincet, entnaald, schaar, etc.)
  • Monoflorale honing
  • Centrifugebuis / reageerbuis
  • Reageerbuishouder
  • Microcentrifuge
  • Microtubes (2 ml)
  • Microtube houder
  • Basisch Fuchsine
  • Glycerine
  • Gelatine
  • Malinol
  • Markeerpen / etiketten
  • Pateurpipet
  • USB warmhoudplaatje
  • Kookwekker
  • Eppendorfpipet met pipetpunten (wit of blauw)
  • Microliterpipet (20 microliter) met pipetpunten (geel)
  • Computer met daarop het programma CombineZP geinstalleerd.


Microscoopcamera (Lucky Zoom, 5 Mp)


USB warmhoudplaatje


Microcentrifuge

 
 

Uitvoering:

Isolatie van stuifmeel uit honing
  • In een centrifugebuis doet men 4 ml honing en 8 ml water.
  • Meng goed, schud  totdat de honing in het water is opgelost.
  • Verdeel de honingoplossing over 8 microtubes m.b.v. een pasteurpipet.
  • Plaats de microtubes in de microcentrifuge en centrifugeer gedurende 10 minuten
    (9V, 10600 rpm, 5650 g).
  • Onder in de microtube zit een beetje waterig residu, het stuifmeel.
  • Haal de microtube(s) uit de centrifuge en giet de waterige oplossing in een keer volledig af.
  • Voeg water toe aan de microtube, sluit het deksel, en schud goed.
  • Plaats de microtube weer in de microcentrifuge en centrifugeer weer gedurende 10 minuten.
  • Voeg met behulp van de Eppendorfpipet 200 microliter water toe, sluit het deksel en schud goed.
  • Breng m.b.v. de pasteurpipet de inhoud van 3 microtubes over in een vierde. Let er goed op dat het stuifmeel overgebracht wordt.
  • Plaats de 2  microtubes tegenover elkaar in de centrifuge.
  • Centrifugeer weer gedurende 10 minuten.
  • Haal de microtubes uit de centrifuge en giet de waterige oplossing af;.

Prepraatbereiding
  • Breng mb.v. de microliterpipet  het stuifmeelmengsel van een druppeltje van het water-stuifmeelmengsel over een objectglaasje.
  • Laat het geheel drogen op een USB warmhouder bij maximaal 40C.
  • Voeg aan het gedroogde stuifmeel links op het glaasje een druppeltje warm gemaakte glycerol-gelatine toe 
  • Breng direct hierop een dekglaasje aan m.b.v. een entnaald.
  • Herhaal deze procedure maar gebruik nu malinol als insluitmiddel.
  • Observeer de preparaten onder de microscoop.


Glycerol/gelatine/fuchsine volgens Kaiser bereiding
  • Week 7 g gelatine in 42 ml water gedurende 2 uur.
  • Voeg daaraan 50 g glycerol (=glycerine) toe.
  • Verwarm voorzichtig gedurende 15 minuten, Het mengsel mag niet koken.
  • Voeg aan 10 ml van de zelf bereide glycerolgelatine 2 tot 4 druppels van een oplossing van 1 gram basisch fuchsine in 100 ml alcohol toe en meng goed.

Resultaat:

Foto van de honingpotjes
Van links naar rechts: Manuka struik honing (1), Lavendel honing (2), Acacia honing (3).
 
Manuka Bush Honing
Mānuka honing die in Australi en Nieuw Zeeland geproduceerd wordt van de nectar van de Manuka boom. Om als Nieuw Zeelandse  Manuka honing getiketteerd te mogen worden moet ca. 70% van het stuifmeel van Leptospermum scoparium komen.

Pollen referentie

Glycerol/Gelatine
Obj 4x - Light Obj 10x - Donkerveld

In nevenstaande en onderstaande foto's heb ik de pollen uit de foto "geknipt".

Obj 10x - Donkerveld  
Obj 20x - Donkerveld Obj 20x - Donkerveld - CombineZP
Obj 40x - Donkerveld Obj 40x - Donkerveld - CombineZP
Mannitol
Obj 10x - Donkerveld Obj 20x - Donkerveld

Het lijkt erop dat manitol de pollen aantast. Details zijn verloren gegaan.

Obj 40x - Licht  
 
Lavendel Honing
Gewonnen uit de nectar van de lavendelbloesems (Lavendula). De honing is goudbruin van kleur. De honing wordt voornamelijk rond de Middellandse zee geproduceerd.

Pollen referentie

Glycerol/Gelatine

Obj 4x - Licht

Obj 10x - Donkerveld
Obj 20x - Donkerveld Obj 20x - Donkerveld - CombineZP
Obj 20x - Donkerveld Obj 20x - Donkerveld
  Obj 40x - Donkerveld - CombineZP
Mannitol
Obj 4x - Light Obj 10x - Donkerveld
Obj 20x - Donkerveld Obj 20x - Donkerveld - CombineZP
Obj 40x - Licht Obj 40x - Licht - CombineZP
 
Acacia Honing
Oorspronkelijk komen acacias komen oorspronkelijk uit Australi, Afrika en Noord- en Zuid-Amerika maar tegenwoordig zijn er ook acaciavelden in Oost Europa (Hongarije of Bulgarije). Er bestaan wel 1300 soorten Acaciaplanten. De honingsoort die verkregen wordt van nectar uit acaciaplant, is erg uniek in haar kleur en vorm, het is een zeer lichte honing, bijna doorzichtig. Deze  honing blijft erg lang vloeibaar door het hoge fructose gehalte.

Pollen referentie

 

 

Glycerol/Gelatine

Obj 4x - Polarisatie Obj 10x - Donkerveld
Obj 20x - Donkerveld Obj 20x - Donkerveld - CombineZP
Obj 20x - Donkerveld Obj 40x - Licht
Obj 40x - Licht Obj 40x - Licht - CombineZP
Mannitol
Obj 10x - Donkerveld Obj 40x - Licht

Discussie:

Honing bevat kleine hoeveelheden stuifmeel of pollen dat afkomstig van de bloemen waar de bijen de nectar gehaald hebben. Iets van dat stuifmeel komt terecht in de nectar en zo uiteindelijk in de honing. Gemiddeld bevat honing tussen de 10.000 en 150.000 stuifmeelkorrels per 10 gram. Pollenanalyse oftewel stuifmeelanalyse is een belangrijk element in het honingonderzoek. Zowel de afmeting, de vorm en de structuur van de stuifmeelkorrel vormen specifieke kenmerken waardoor het stuifmeel microscopisch te determineren is. Door pollenanalyse kan men vaststellen wat de draagplanten zijn en uit welke regio de pollen die in de honing zitten afkomstig zijn. Men kan op deze manier zowel de botanische als de geografische herkomst van de honing bepalen. Het werk van een imker wordt op deze manier beoordeeld en gecontroleerd op manipulatie van de honing, zoals bijvoorbeeld honingfiltratie of toevoeging van pollen.
In dit experiment hebben we drie monoflorale honing bestudeerd m.b.v. de microscoop. De belangrijkste kenmerken zijn samengevat in onderstaande scan van de verpakking.
Het onderzoek laat zien dat we inderdaad de pollen kunnen terugvinden die typerend zouden zijn voor het type honing. Wat opgemerkt kan worden is dat het niet altijd eenvoudig was om een goede referentie te vinden. Dat is een onzekerheid die men niet helemaal kan wegnemen. Ook is goed te zien dat men niet alleen maar de typerende pollen terugvindt in de honing. Andere pollen zijn ook aanwezig.

Vooral bij de Manuka Bush honing lijken meer andere pollen aanwezig te zijn. Hier kan men dan wel weer opmerken dat sommige pollen mogelijk niet altijd in een eenduidige configuratie waar te nemen zijn. Puur visueel lijkt het er echter niet op dat 70% van het stuifmeel inderdaad van Leptospermum scoparium is. Een aanwijzing in deze is ook op de verpakking vermeld staat dat het hier om een "blend" gaat.  Gezien het duidelijk monoflorale karakter van de andere honingen alsmede de visuele observatie dat deze honing erg rood en korrelig is ben ik geneigd om deze honing desalniettemin als monofloraal te karakteriseren.

Een tweede experiment dat we hier hebben uitgevoerd is het gebruik van mannitol als insluitmiddel. Mannitol lijkt echter niet geschikt te zijn voor dit doel. Het lijkt erop of mannitol of het oplosmiddel (xyleen) waar de mannitol inzit de pollen aantast waardoor structuurkenmerken verloren gaan. Zoals de literatuur al aangeeft is glycerol/gelatine beter geschikt als insluitmiddel voor stuifmeel.

 

Conclusies:

  • Gebaseerd op dit onderzoek lijkt het erop dat we kunnen concluderen dat de bestudeerde honingpotjes inderdaad monoflorale honing bevat.
  • Mannitol is niet geschikt als insluitmiddel voor pollen aangezien het de structuur lijkt aan te tasten.

Literatuur:

  • "Cursusboek Honingkunde"; NBV; 2003.
  • Rob Kesseler en Madeline Harley; "Pollen"; Veen Magazine; 2009 (2006); ISBN 9789085712749.
  • M.N.B.M. Driessen, J.W.M. Derksen, F.Th.M. Spieksma, E. Roetman; "Pollenatlas van de Nederlandse atmosfeer"; Fisons Pharmaceuticals BV; 1988; ISBN 9090020861.
  • R.W.J.M. van der Ham, J.P. Kaas, J.D. Kerkvliet, A. Neve; "Pollenanalyse"; Stichting Landelijk Proefbedrijf voor insektenbestuiving en Bijenhouderij Ambrosiushoeve; 1999.
  • Owen Meyer; "Microscopy on a Shoestring for Beekeepers and Naturalists"; Northern Bee Books; 1984; ISBN 9780907908104.
  • Dr. A. Schierbeek; "De Wonderwereld van het Microscoop"; van Stockum; 1946; p. 48-50.
  • Cyril Bibby; "Biologie als Hobby"; GJA Ruijs; p. 79.
  • C. van Duijn Jr; "Inleiding tot de Mikroskopische Techniek"; Kluwer; 1950; p. 157-159.
  • D. G. Mackean; "Inleiding tot de biologie"; Wolters-Noordhoff; 1969; ISBN 9001568009; p. 37,40-43.
  • David Burnie; "Planten"; Standaard Uitgeverij; 2003 (1990); ISBN 9045900688; p. 17,23.
  • Chris Oxlade en Corinne Stockley; "De Microscoop"; Usborne Publishing; 1995; ISBN 9054570342; p. 27.
  • Dr. H.H. Kreutzer; "Plantkunde I"; Noordhoff; 16de druk; p. 38-46.
  • Dr. J. Hamacher; "Biologie fur Jedermann"; Franckh'she Verlagshandlung; 1934; 4de druk; p. 42-44.
  • Hans Schouten; "Mikroskopie voor op school en thuis"; Stichting Media Publieksvoorlichting en Onderwijs; 1987; ISBN 9072001029; p. 154-159.
  • Koninklijk Antwerps Genootschap voor Micrografie; "Microscopie als hobby"; 2013; p. 72-75,102,103.
  • Bruno P. Kremer; "Das Grosse Kosmos-Buch der Mikrokopie"; Kosmos; 2010 (2002); ISBN 9783440125335; p.213-219.

Relevante websites:

Minder relevante websites:

Opmerkingen:

  • Men is uiteraard niet verplicht een microcentrifuge te gebruiken. Een handcentrifuge of "gewone" centrifuge bereikt hetzelfde doel.
  • Het Cursusboek Honingkunde is een uitstekend boekje om meer over het werk van een imker te weten te komen. Het allermooiste is dat men het gratis als pdf kan downloaden. 
  • Een glycerol/gelatine preparaat is jaren houdbaar.
  • Drogen kan ook aan de lucht of op een CV-radiator. Belangrijk is dat men niet boven een temperatuur van 40 C droogt.
  • Donkerveldmicroscopie is een vorm van microscopie waarbij het preparaat zodanig wordt belicht dat er geen ander licht dan van het preparaat zelf in het beeldveld kan komen. Men ziet het preparaat dus tegen een zwarte achtergrond. Op deze manier is het in principe mogelijk om partikeltjes te zien die kleiner zijn (ten opzichte van de golflengte van het gebruikte licht) dan theoretisch mogelijk is met gewone belichting
  • Stacking ook wel "focus stacking" genoemd kan men beschouwen als het  "stapelen van brandpunten". Foto's met verschillende scherptediepte-instellingen worden softwarematig samengevoegd tot n geheel scherpe foto.  Praktisch gezien voer men dit uit door eerst de camera scherp te stellen op het voorste (bovenste) punt van het onderwerp dat men wil fotograferen. Maak vervolgens de foto en verleg dan het scherptepunt een beetje dieper. Maak wederom een foto en herhaal deze bewerking totdat het gehele voorwerp is doorlopen. Vervolgens laadt men de individuele foto's in speciale sofware die deze dan samenvoegt tot een enkele foto. De meest gebruikte stacking programma's zijn:
     

 

Achtergrondinformatie:

Het stuifmeel bevat de mannelijke geslachtorganen oftewel gameten. Het stuifmeel zit opgeslagen in de helmknop van de meeldraad. Het overbrengen van stuifmeel van de helmknoppen van de ene bloem op de stempel van een andere bloem die tot dezelfde soort hoort heet bestuiving.

Er zijn in principe twee mechanismes voor bestuiving nl insektenbestuiving en windbestuiving. Stuifmeelkorrels die door insekten meegedragen worden bevatten vaak fijne uitsteeksels zodat het stuifmeel makkelijk aan het insekt blijft vastkleven. Stuifmeel dat door de wind meegedragen wordt is glad en bevat luchtblaasjes die het oppervlak groter maken zodat de korrel makkelijker door wind gedragen kan worden.

Qua grootte variren stuifmeelkorrels, afhankelijk van de soort, tussen de 20 - 40 micrometer ( vergeet-me-nietje 8 m, mas 100 m, sierpompoen 200 m, koolzaad 27 m, tamme kastanje 12 m).

Een stuifmeelkorrel is opgebouwd uit een harde buitenwand, de exine. Onder deze exine bevindt zich de intine, een dun huidje dat de inhoud van de korrel omgeeft. De exine bezit vaak een kenmerkende structuur, zoals groeven over het oppervlak of een netwerk.

De exine bevat plaatsen waar de wand dunner is. Op deze plaatsen zal tijdens de kieming de pollenbuis groeien. Er zijn globaal drie soorten vormen; spleten, ronde porien en spleten met een porie. Veel stuifmeelkorrels hebben drie van die kiemopeningen (stuifmeel van klaver bezitten 3 spleten met op elke spleet een ronde porie, pollen van Prunus bezitten 3 en soms 4 spleten met op elke spleet een porie).


24/06/2017