Gist

Experimenteren met gist

Datum: November 2021

Inleiding:

Een herhaling van een eerder uitgevoerd experiment met uitbreidingen en moderner apparatuur.

Materiaal:

Euromex Bioblue BB 4253 Microscoop uitgeruste met Canon 450D camera Computer met de benodigde software geïnstalleerd (CoachLab, S-EYE, CANON software) Verwarmingsplaat met roermotor Roerboon Gist Water Fructose Dextrose Sucrose (suiker) Methyleenblauw oplossing (0.1% aq.) Calciumhydroxide (Ca(OH)₂) Minerale olie Bekerglas Erlenmeyer CMA Coachlab Druksensor (0341BT) Temperatuursensor (0511BT) Pipet Balans Objectglaasjes Dekglaasjes Ballon Einhorn saccharose meter Rietje of glazen staafje Slangen Kurken, doorboord Mikroschaal kit Zandbad verwarmer Hemocytometer Reageerbuizen Reageerbuisrek
CMA Coachlab	Druksensor
Temperatuursensor	Hemocytometer
Microschaal experimenteer kit	Zandbad verwarmer

Uitvoering:

Gist suspensie
Maak een oplossing van 5% suiker in 50 ml water in een erlenmeyer Als de suiker opgelost is voeg dan 1g gist toe Meng goed en plaats op een warmhoudplaat Verwarm voor 5 min Om de gistsuspensie te activeren brengt men deze op een temperatuur van 30 - 40 °C
Microscopisch onderzoek
Neem met een pipet een druppel gist suspensie en plaats deze op een object glaasje Plaats een dekglaasje Observeer onder de microscoop (objectief 60x) Maak ook een preparaat waar methyleenblauw aan is toegevoegd (1:1)
Fermentatie met het toestel van Einhorn en met een ballon en erlenmeyer
Toestel van Einhorn Maak een oplossing van 5% fructose Voeg een spatelpunt gist toe Meng goed Haal de stop van het toestel van Einhorn Giet de gist suspensie in het toestel totdat het 0 maatsreepje bereikt is. Plaats de stop terug Observeer "Ballon fermentatie" Giet de resterende suspensie over in een erlenmeyer Plaats een haakse glasbuis in een doorboorde kurken stop. Bevestig een ballon op het uiteinde Alternatief: plaats de ballon gewoon over de opening Laat staan
Coachlab experimenten
Bouw de opstelling op van PC, Coachlab, Temperatuursensor en Druksensor Neem een bekerglas van 400 ml, vul het met water en plaats er een roerboon in Plaats het bekerglas op de verwarmingsplaat Zet de roermotor aan en stel de gewenste temperatuur in Positioneer het statief dusdanig dat de reageerbuis en de temperatuur sensor in het bekerglas geplaatst worden Maak een gistsuspensie van 5% gist in water Maak een suikeroplossing van 5% suiker in water Pipetteer 2 ml gist suspensie in de reageerbuis Pipetteer 2 ml suikeroplossing in de reageerbuis
Voeg een klein beetje (laagje) minerale olie toe Meng goed Draai de stop met daaran in de drukmeter bevestigd in de reageerbuis Plaats de reageerbuis in het waterbad Start de Coachlab meting (6 metingen per minuut, meet druk en temperatuur) Voer de fermentatie reactie uit met verschillende suikers bij verschillende temperaturen: kamertemperatuur, 25, 35 en 45 °C. Selecteer een suiker en voer de fermentatie reactie uit bij verschillende gist suspensie concentraties: 0.5%, 1%, 2%, 5% Selecteer een suiker en voer de fermentatie reactie uit met een gist suspensie concentratie van 1% maar met verschillendende suiker concentraties: 0.5%, 1%, 2%, 5% Analyseer de resultaten Ik heb de resultaten geëxporteerd als CSV file en geïmporteerd in Excel voor verdere analyse


CO2 aantonen
Vul een buis met 50 ml water Voeg 5 g fructose toe Voeg 2.5 g gist toe Meng goed Maak een calciumhydroxide oplossing in water door een spatelpunt calciumhydroxide in water op te lossen Filtreer deze oplossing af in een kleine erlenmeyer Steek een doorboorde stop met slang erin op de buis met suiker/gist oplossing Steek de andere kant van de slang in de calciumhydroxide oplossing Observeer

Destillatie van suiker/gist oplossing
Bouw m.b.v. der microschaal kit de destillatieopstelling op zoals weergegeven in nevenstaande figuur Pipetteer 2 ml van de uitgewerkte suiker/gist suspensie in de kolf Start de verwarming op (langzaam opwarmen) Observeer
Gistcellen tellen met de hemocytometer
Maak een verdunningsreeks van gistcellen in een suikeroplossing, uitgaande van 1 g/l en vervolgens 1 op 10 te verdunnen Voeg een druppel methyleenblauw oplossing toe aan de verdunningen Plaats een druppel van een van de verdunde oplossingen op de hemocytometer Tel de cellen binnen een kwadrant (gemarkeerd door dubbele lijnen)

Resultaten en discussie:

Lichtmicroscoop
Objectief: Euromex Phase DM 60X 0.40 DIN
Gitcellen onder de microscoop. In de zoom kan men gistcellen zijn die aan het delen zijn. Met methyleenblauw gekleurde gistcellen. Levende gistcellen zijn levend, blauwgekleurde zijn dood. Een levende eencellige zoals gist breekt het methyleenblauw af door een reactie met een proton als het opgenomen wordt en zal daarom niet blauw kleuren.
Gistsoorten vormen een zeer ongewone familie der fungi. De meeste bestaan uit afzonderlijke bolvormige cellen. Bij de gisten omsluit een dunne celwand het protoplasma, in het midden waarvan zich een vacuole bevindt. Een speciaal protoplasmakorreltje, de nucleolus, is hieraan bevestigd. Beide delen samen vormen de kern. In het protoplasma liggen korreltjes glycogeen en ander reservevoedsel. De cellen planten zich voort door spruiting of knopvorming, waarbij een uitstulping van de cel groter wordt en ten slotte als een onafhankelijke cel van de ouderplant wordt afgesnoerd. Als de knopvorming snel plaatsvindt, laten de afzonderlijke cellen niet direct los en het gevolg is dat men soms groepjes aan elkaar vastzittende cellen kan zien.

*Resultaat Toestel van Einhorn en Erlenmeyer ballon na 24 uur*


			Na 104 minuten kan men echter al CO₂ zien doorslippen.
0 min, 0 %	5 min, 0.05 %	104 min, 1 %
		Ik heb dit experiment herhaald met een sucrose oplossing van 1 %. De saccharometer geeft na enige tijd 0.2 % aan. Nu moet ik toegeven dat ik niet exact het voorschrift volg. Ik laat deze nl. bij kamertemperatuur staan en plaats deze niet in een stoof om de oplossing the conditioneren.
Beide experimenten laten zien dat er een gas gevormd wordt. Ook in de aantoningsreactie laat de belletjesvorming zien dat er een gas gevormd wordt. Dat we met inderdaad met CO₂ te maken hebben wordt aangetoond door wat gevormd gas door een kalkwater oplossing te leiden. De oplossing van kalkwater wordt troebel hetgeen de aantoningsreactie voor CO₂ is volgens: CO₂ (g) + Ca(OH)₂ --> CaCO₃ (s) + H₂O

Destillatie van suiker/gist oplossing
Ik vroeg me af of ik wat alcohol kon overdestilleren. De temperatuur stopte echter pas bij 95 °C en de druppel die ik overgedestilleerd heb kon ik niet aansteken hetgeen aangeeft dat het een waterdruppel was. Het overdestilleren van alcohol i(kookpunt ca. 78 °C) s dus niet gelukt.

Coachlab experimenten
Verwerking temperatuur data Importeer de csv file in excel Converteer de data naar getallen via "text to columns" Bereken de gemiddelde temperatuur Converteer de uren naar minuten in een nieuwe kolom Maak een plot van de druk en temperatuur vs de tijd (zie nevenstaande figuur) Selecteer een recht deel van de curve
Normaliseer de tijd (breng het beginpunt baar 0) Bereken de regressielijn (zie voorbeeld nevenstaande figuur) Verzamel de regressielijnen (slope, intercept) Gebruik deze om een opgeschoonde grafiek te maken zoals weergegeven in onderstaande figuur.
4 De in de gist aanwezige enzymen kunnen bepaalde suikers vergisten tot ethanol. Bij de gisting van gewone suiker heeft men te maken met een proces dat opgebouwd is uit twee stappen: 1. De suiker wordt gehydrolyseerd door de in de gist aanwezige enzymen tot glucose en fructose. Reactie : C₁₂H₂₂O₁₁ + H₂O -----> 2C₆H₁₂O₆ (glucose/fructose) 2. Glucose en fructose worden dan door de in de gist aanwezige enzymen omgezet in ethanol en CO₂. Reactie : C₆H₁₂O₆ -----> 2C₂H₅OH + 2CO₂ De netto reactie wordt dan: C₁₂H₂₂O₁₁ + H₂O -----> 4C₂H₅OH + 4CO₂ De toename van de hellingshoek bij oplopende temperatuur geeft aan dat de reactie sneller verloopt bij toenemende temperatuur (kinetiek wordt sneller, zie Achtergrondinformatie). Volgens de literatuur zou de fermentatie snelheid stijgen bij temperaturen van 10 to 40 °C en daarboven weer afnemen. Dat kunnen we inderdaad in bovenstaande en onderstaande grafieken waarnemen. De vergistings snelheid is lager of neemt niet meer toe bij een temperatuur van 48 °C (gestippelde lijn). Bij te hoge temperatuur denatureren de vergistingsenzymen (invertase of sucrase) en verliezen dan hun katalytische aktiviteit.

Daarnaast hebben we voor fructose onderzocht of we een verschil kunnen waarnemen bij een variatie in suiker (in dit geval fructose) en gist concentraties. Hierbij zou een variatie in de gist concentratie overeenkomen met een variatie in enzymconcentratie. Onderstaande grafieken zijn nagenoeg identiek waardoor ik me na de dataverwerking afvroeg of ik een fout heb gemaakt bij het verzamelen en verwerken van de data. Voor zover ik het nog kan nagaan niet. Volgens de MM-kinetiek (zie achtergrondinformatie) heeft de enzym concentratie (gist) wel degelijk invloed op de reactiesnelheid en dat zien we in de onderste grafiek.

Gistcellen tellen met de hemocytometer

De hemocytometer wordt normaal gebruikt om bloedcellen te tellen maar in de vergistingsindutrie wordt deze ook wel gebruikt om m.b.v. methyleenblauwkleuring de verhouding tussen levende en dode cellen te bepalen. Zoals men in onderstaande foto kan zien zijn er meer zeer weinig dode cellen in het monster, 105 cellen in het kwadrant waarvan 6 blauwgekleurd.

Literatuur:

Koninklijk Antwerps Genootschap voor Micrografie; "Microscopie als hobby"; 2013; p. 75.

D.G. Mackean; "Inleiding tot de Biologie"; Wolters-Noordhoff; 1969; 6de druk; ISBN 9001568009;p. 92.

F. Roelandse; 'Alcoholische gisting'; DJO; 1975 5; blz. 128-130.
A. Meesters et al; 'practicum biologie'; Stichting Onderwijs Orientatie; 1970; ISBN 9023140206; blz.38-40.
Cyril Bibby; 'Simple experiments in biology'; Heinemann; 1956 (1969); p. 122.
Cyril Bibby; 'Biologie als hobby'; Ruys; 19??; p. 131,169,170.
David Burnie; De Natuur ontdekken; Davidsfonds/Infodok; 2000; ISBN 9065655387; blz. 67.
Judith Hahn; De Jonge Onderzoeker; Het Spectrum; 1980; ISBN 9027492689; blz. 127.
H.Scott Fogler; 'Elements of Chemical Reaction Engineering'; Prentice-Hall; 1986; ISBN 013263666; blz. 328-337.
Allan Jones, Rob Reed and Jonathan Weyers; 'Practical Skills in Biology'; Addison Wesley; 1994; ISBN 0582066999; blz. 149-152, 159-164.
Lubert Stryer; 'Biochemistry'; Freeman; 1975,1981, 2nd Ed.; ISBN 0716712261; p. 103-134.
L. Halleman; "Klinische chemie und Mikroskopie"; 1947; 5de druk; Thieme; p. 142,143.
Larry N. Reinking, Jeffrey L. Reinking, Kenneth G. Miller; 'Fermentation, Respiration & Enzyme Specifity: A Simple Device & Key Experiments with Yeast'; The American Biology Teacher; 56 3 1994; p. 164-168.
David Dressler, Harrington Potter; "Enzymen Gangmakers in de natuur"; Natuur & Techniek; 1992; ISBN 9070157993; p. 23-37.

Relevante websites:

Minder relevante websites:

NGVM

Opmerkingen:

Initieel had ik het sampling snelheid in Coachlab te hoog ingesteld en verzamelde daarmee teveel datapunten. Dat heb ik gereduceerd bom processing van de data te vergemakkelijken.
Suikergehaltemeter volgens Einhorn: de gistings saccharometer is ontwikkeld voor het bepalen van het suikergehalte in urine (zie achtergrondinformatie).
Gist. Duits: Hefe
Coachlab file:
Excel file: resultaten.xlsx

Achtergrondinformatie:

Suikers
Naam: sacharose Triviaalnamen: (kristal)suiker, sucrose, rietsuiker, bietsuiker Formule: C₁₂H₂₂O₁₁
Naam: glucose Triviaalnamen: druivesuiker, dextrose, aldohexose Formule: C₆H12O6
Naam: fructose Triviaalnamen: vruchtensuiker, ketohexose Formule: C₆H₁₂O6

Gisten

Gisten zijn eencellige micro-organismen met een grootte van circa 0,005-0,020 mm. Anders dan bacteriën hebben gistcellen hun DNA in de celkern opgeborgen; dat hebben zij gemeen met planten, dieren en mensen, waardoor zij ingedeeld zijn bij de eukaryote organismen.

Al vele duizenden jaren spelen gisten een belangrijke rol in het leven van de mens. De oudst bekende vorm van gistgebruik is de spontane omzetting van granen in bier en van druiven in wijn. Daarnaast wordt gist al eeuwen ingezet voor het laten rijzen van brooddeeg; aanvankelijk werd hiervoor de gist gebruikt die overbleef na de biergisting, maar sinds het eind van de negentiende eeuw wordt bakkersgist in toenemende mate gekweekt. Gist wordt ook gegeten. Als vitaminesupplement zijn er gisttabletten en als broodbeleg is er gistpasta(marmiet) te koop. Gist in de vorm van gistextract wordt als hartige smaakstof toegevoegd aan veel voedingsmiddelen, vooral aan soepen en sauzen.

Dankzij het onderzoek van Louis Pasteur (1822-1895) werd duidelijk dat tijdens de wijngisting een toename optrad van het gewicht van de gist die gekoppeld was aan een toename van de hoeveelheid geproduceerde koolstofdioxide. Hieruit concludeerde hij dat er een chemische omzetting plaats vond. Verder onderzoek toonde aan dat gistcellen verantwoordelijk zijn voor de omzetting van suikers in alcohol en koolstofdioxide. Tevens bleken extracten van gistcellen ook andere chemische reacties te katalyseren. De hiervoor verantwoordelijke stoffen werden enzymen Genoemd, wat in het Grieks "in gist" betekent.

Alle tot nu toe bekende gistsoorten zijn in staat om tenminste één suiker, bijvoorbeeld glucose of fructose, te gebruiken als enige bron van koolstof en energie. In aanwezigheid van zuurstof, dus bij de dissimilatie van de gist worden de suikers geheel omgezet in water en koolstofdioxide. Er wordt zoveel energie geproduceerd dat de gistcellen zich snel kunnen vermeerderen. Bij de alcoholische vergisting worden de gistcellen bij afwezigheid van zuurstof gedwongen om de suikers maar gedeeltelijk af te breken om in hun energiebehoefte te voorzien, dit levert echter veel minder energie op, als bijproducten ontstaan alcohol en CO₂. Ook bij het broodbakken treedt een alcoholvergisting op.

Enzymkinetiek

De vergistingsreactie verloopt aangezien er enzymen aangemaakt worden die ervoor zorgen dat de reacties kunnen verlopen.

Een enzym is een eiwit met katalytische eigenschappen, vanwege hun vermogen om specifieke bindingen te activeren (de activeringsenergie wordt verlaagd).

Een enzym heeft naast een eiwitgedeelte (het apo-enzym) vaak nog een andere bouwsteen (de cofactor) nodig voor de katalyserende functie. Het geheel noemt men holo-enzym.

Als cofactor kunnen optreden metaal-ionen (bv Ca²⁺) of een complex organisch molecuul dat als coenzym functioneert bv NADH

De enzymkinetiek gedraagt zich niet wezenlijk anders dan de normale chemische kinetiek. Vaak heeft men te maken met pseudo-1^ste-orde kinetiek (bv als in een 2^de orde reactie een de concentraties zeer hoog is en de andere concentratie zeer laag).

In een 1^ste orde reactie is de reactiesnelheid evenredig met de concentratie van een reactant.

Voor de reactie: S --> P

Geldt dan:

dus

Hieruit volgt ook dat de concentratie van P gemakkelijk te berekenen is volgens:

[P] = [S]₀ – [S] (waarin [S]₀de concentratie van S op tijdstip t=0 is).

Het concentratieverloop is grafisch weergegeven in onderstaande figuur.

Bij een enzymatische bepaling laat men het enzym enige tijd inwerken op het substraat en bepaald men de substraat (S) of product (P) concentratie op verschillende tijdstippen (of continue). De kromme die het verband weergeeft tussen bv de hoeveelheid omgezet substraat (de conversie) en de tijd, noemt men de progress-curve.

We kunnen in de progress-curve zien dat de conversie van S steeds verder van de raaklijn afwijkt. Voor deze afwijking zijn verschillende oorzaken mogelijk:

De concentratie van S neemt af en de reactie verloopt volgens de 1^ste orde kinetiek
De concentratie van P neemt toe, zodat bij een reversibele reactie, de omgekeerde reactie steeds sneller loopt.
Het gevormde P remt soms de reactie (negatieve feedback).
Het enzym wordt minder actief door denaturatie.

Om van deze afwijking geen last te hebben moet men dus meten rond t=0.

Het effect van de verschillende enzymconcentraties kan nog duidelijker zichtbaar gemaakt worden door de reactiesnelheid (de omgezette hoeveelheid per tijdseenheid) als functie van de enzymconcentratie uit te zetten. Door het maken van zulk een curve kan men zien dat alleen op t=0 er een lineair verband bestaat tussen de enzymwerking (reactiesnelheid) en enzymhoeveelheid. De juiste reactiesnelheid wordt dus gevonden door op t=0 de raaklijn aan de progress-curve te trekken. Deze reactiesnelheid noemt men de initial velocity (v₀).

Er zijn een aantal factoren die van invloed zijn op de reactiesnelheid (initial velocity):

de enzymconcentratie [E]
de substraatconcentratie [S]
de pH
de temperatuur
remmers (inhibitoren) en aktivatoren

In 1913 ontwikkelden L.Michaelis en M.Menten (MM) een algemene theorie over de werking van enzymen. Briggs en Haldane breidden deze theorie later uit. Deze uitbreiding staat bekend onder de naam steady-state theorie. De MM theorie vormt de basis van de kwantitatieve analyse van alle aspecten van enzymkinetiek en inhibitie en is het best ontwikkeld voor een (1) substraat. De MM theorie gaat er van uit dat een enzym E met het substraat S een enzymsubstraat complex ES vormt dat in een tweede stap uiteenvalt in vrij enzym E en product P (beide reacties zijn reversibel). De MM vergelijking afgeleid volgens de steady-state theorie geeft het mathematische verband tussen de initiële snelheid (initial velocity), de concentratie S en enkele karakteristieke kenmerken van een enzym.

Reactie:

Symbolen:

e = totale concentratie enzym
p = concentratie ES ( dus e-p = concentratie vrije enzym !)
s = concentratie vrije substraat
v_o = initial velocity (beginsnelheid)
k = reactieconstante

Volgens de steady state theorie is de vormingssnelheid van ES gelijk aan de ontledingssnelheid.

De vormingssnelheid van ES: (1)

Hier verwaarlozen we de terugvorming uit P aangezien op t=0 geldt P=0.

De ontledingssnelheid van ES: (2)

(1) = (2) ==> (3)

Dus: (4)

De initial velocity (reactiesnelheid op t=0) wordt bepaald door de productvorming uit ES:

(5)

(4) in (5) geeft: (6)

De maximale reactiesnelheid (V_max, S --> ) wordt dan: (7)

De constante (8) noemt men de Michaelis-Menten constante.

(7) en (8) in (6) geeft de Michaelis-Menten vergelijking:

Michaelis-Menten vergelijking:

Consequenties:

s is laag << 1 is verwaarloosbaar t.o.v. Km/s -->
V₀is evenredig met S (1^ste orde).
s is zeer hoog --> Km/s te verwaarlozen t.o.v. 1 -->
V₀ onafhankelijk van s (0^de orde).
V₀ = ½ V_max -->
K_M is dus gelijk aan de substraatconcentratie die aanleiding geeft tot een initial velocity die gelijk is aan ½ V_max.

De vorm waarin de MM vergelijking is gegoten is onhandig om uit de experimentele gegevens K_M en V_max te bepalen. Daarom heeft men deze vergelijking getransformeerd naar een lineaire vergelijking (door de reciproke te nemen) waarmee men de Lineweaver-Burk plot kan verkrijgen (die een rechte lijn geeft als men 1/v₀ t.o.v. 1/s uitzet).

Helling = K_M/V_maxSnijpunt y-as = 1/V_maxSnijpunt x-as = -1/K_M

Saccharometer
Bron: L. Halleman; "Klinische chemie und Mikroskopie"; 1947; 5de druk; Thieme; p. 142,143.