Alcoholische gisting

Datum: december 2002 - februari 2003

Principe:

Gistingsactiviteit nader bestuderen.

Materiaal:

  • water
  • zout
  • suiker
  • slang
  • maatcilinder (50 ml)
  • stopwatch
  • slangenklemmetje
  • fles die afsluitbaar is met een kurk (in mijn geval 50 cl spa flesje)
  • glazen buisje met kurk dat op de fles past (of rubber afsluitdop en infuusslangetje met holle naald eraan)
  • bak of schaal 
  • gist

Uitvoering:

  • Maak 500 ml 10% zoutoplossing en doe deze in het het bakje of schaaltje.
  • Maal een 10% suikeroplossing door 25 g suiker op te lossen in 250 g water.
  • Zorg ervoor dat alles goed opgelost is.
  • Vul de cilinder met de zoutoplossing. Zet hem op zijn kop in de bak met zoutoplossing en noteer de op welke maatstreep het water niveau begint.
  • Voeg 10 g gist toe aan de suikeroplossing en zorg ervoor dat het gist goed mengt met de suikeroplossing.
  • Sluit de fles af met de kurk, plaats de slang op het glazen pijpje en zorg ervoor dat het andere uiteinde van de onder de maatcilinder uitkomt zodat alle CO2 de cilinder inloopt.
  • Noteer het tijdstip en meet regelmatig hoeveel water er verdrongen is in de maatcilinder.
  • Als alle water verdrongen is klem de slang dan af en vul de cilinder opnieuw.
  • Na enkele uren uren schakelen we over op activiteitsmeting, we bepalen dan de tijd benodigd om de maatcilinder te vullen met 50 ml gas.
  • Indien we de volledige vergistingcurve willen bepalen kan het experiment meerdere (3-5) dagen duren.

Meetresultaten:

EXPERIMENT 1 Temperatuur : 22.5 C

opstelling

Continue Meeting Start experiment: 
29 december om 16:42 u.
Tijd (hh:mm) ml verplaatst
00:00
00:15
00:30
00:32
00:39
00:46
00:52
00:58
01:03
01:07
01:12
01:17
01:21
01:26
01:30
01:35
01:39
01:44
01:49
0
4
30
41
87
137
189
244
294
344
394
444
494
544
594
644
694
744
794
Gist oplossing: 10 g
Suiker: 26 g
Water: 250 g
Op het moment, na ca. 2 uur toen overgeschakeld zou worden naar activiteitsmetingen moest het experiment afgebroken worden. Door de schuimvorming werd de gistsuspensie door het slangetje geperst.

gasvorming

Tijdens het experiment hebben we wat gas door een oplossing van kalkwater geleid. Deze werd troebel.

voor

na

EXPERIMENT 2 Temperatuur : 21.5 C
Continue Meeting Start experiment: 
30 december om 14:34 u.
Tijd (hh:mm) ml verplaatst
00:00
01:00
02:15
04:46
04:50
05:02
0
0
0
0
10
58
Gist oplossing: 3 g
Suiker: 27 g
Water: 250 g

De gistconcentratie verlaagd om 2 redenen. Het effect hiervan bepalen en hopelijk resulteert dit in minder sterke schuimvorming.

Waarschijnlijk een lek op de afsluiting gehad. Daarom initieel geen activiteit gemeten. Ik kon dit zien aan de schuimvorming. Daarom overgegaan op activiteitsmetingen in min/50 ml gas productie. Wederom werd dit experiment geplaagd door sterke schuimvorming na ca. 6 uur.
Activiteitsmeting
Tijd (hh:mm) min/50 ml CO2
05:02-05:15
06:04-06:19
19:33-20:35
31:00-32:12

 

13
15
62
72
EXPERIMENT 3 Temperatuur : 21.5 C
Continue Meeting Start experiment: 
1 januari om 13:55 u.
Tijd (hh:mm) ml verplaatst
00:00
01:00
01:30
01:46
02:10
02:28
02:44
02:59
03:13
03:26
03:39
03:52
04:04
04:18
0
18
33
50
102
152
202
252
302
352
402
452
502
554
Gist oplossing: 3 g
Suiker: 12 g
Water: 200 g


De suikerconcentratie verlaagd om het effect hiervan bepalen. Ik verwacht ook minder CO2 productie.

Na 15 min. de eerste CO2 bellen.

Ook nu is na 6-7 uur de schuimvorming dermate groot geworden dat men niet zo goed kan meten omdat het slangetje zich dan met gist vult.

Activiteitsmeting
Tijd (hh:mm) min/50 ml CO2
04:58-05:12
19:00-20:14
22:55-24:07
27:23-28:15
29:37-30:18
43:38-51:20
14
74
72
100 (26 ml)
89 (23 ml)
513 (45 ml)
EXPERIMENT 4 Temperatuur : 21.2 C
Continue Meeting Start experiment: 
4 januari om 18:30 u.
Tijd (hh:mm) ml verplaatst
00:00
00:20
00:45
00:52
01:07
0
8 (?)
19 (?)
30 (?)
50 (?)
Gist oplossing: 3 g
Suiker: 25 g
Water: 200 g

(?) vermoedde een lek, veel geschud en geprobeerd.

Activiteitsmeting
Tijd (hh:mm) min/50 ml CO2
02:07-02:26
02:28-02:44
02:45-03:00
03:03-03:18
03:18-03:33
03:34-03:48
04:48-05:05
16:24-17:36
17:57-18:52
23:27-25:32
19
16
15
15
15
15
17
68 (53ml)
55
(35 ml)

Na 4 experimenten was de gist op.

Discussie: 

In de gist aanwezige enzymen kunnen bepaalde suikers vergisten tot ethanol. Bij de gisting van gewone suiker heeft men te maken met een proces dat opgebouwd is uit twee stappen:

1. De suiker wordt gehydrolyseerd door de in de gist aanwezige enzymen tot glucose en fructose.

Reactie :  C12H22O11 + H2O -----> 2C6H12O6 (glucose/fructose)   

2. Glucose en fructose worden dan door de in de gist aanwezige enzymen omgezet in ethanol en CO2.

Reactie :  C6H12O6 -----> 2C2H5OH + 2CO2   

De netto reactie wordt dan: C12H22O11 + H2O -----> 4C2H5OH + 4CO2

Dat inderdaad CO2 gevormd wordt hebben we aangetoond door wat gas door een kalkwater oplossing te leiden:
   
Waarneming : De oplossing van kalkwater wordt troebel 
   
Reactie : CO2 (g) + Ca(OH)2 --> CaCO3 (s) + H2O

Een volledige vergistingcurve, waarbij de activiteit op de y-as wordt geplot t.o.v. de tijd zou eruit zien zoals in de figuur hiernaast. 

Helaas hebben we niet genoeg datapunten verzameld tijdens een van de experimenten om een dergelijke curve te kunnen samenstellen.

Om relevante conclusies te kunnen trekken is dit echter ook niet nodig, de initile activiteit is daarvoor voldoende, zoals we laten zien bij de behandeling van de enzymkinetiek (zie achtergrondinformatie).

 

Vertalen we de meetresultaten in grafieken dan krijgen we het hieronderstaande resultaat.

 

CO2 produktie

activiteit

Dit zijn echter min of meer rechtlijnig afgeleide grafieken. We willen echter een Lineweaver-Burk plot maken
(Zie Achtergrondinformatie voor meer details over deze plot).
Vatten we alle resultaten samen in een tabel:

Lineweaver - Burke plot

s act e 1/s 1/act
% min/50 ml CO2 % 1/% 50 ml CO2/min
5.6 13 1.4 0.1786 0.0769
9.1 4.5 3.5 0.1099 0.2222
9.6 14 1.1 0.1042 0.0714
11 15 1.3 0.0909 0.0667

De resultaten van EXP 1 zijn niet bruikbaar voor de LB plot aangezien de gist concentratie sterk verschillend is t.o.v. de andere experimenten. We kunnen uit dit experiment, indien we het vergelijken met de andere,  echter wel concluderen dat een toename van de enzymconcentratie de reactie versneld.

Plotten we de zo verkregen waarden in een LB plot dan krijgen we nevenstaand resultaat met act in min/50 mol CO2 en s in %.

Met Snijpunt y-as = 1/Vmax en Snijpunt x-as = -1/KM
Krijgen we:
KM = 2.2 (in % oftewel g/100g)
Vmax = 17.8 (min/50 ml CO2)

Normaliter worden dergelijke getallen echter in mol/l en mol/min uitgedrukt. 

We kunnen de getallen hierboven echter (grofstoffelijk) omrekenen:
De dichtheid van de oplossing (1.03 g/ml) en de molmassa van de suiker (342 g/mol) gebruiken we om de concentratie van de oplossing uit te rekenen in mol/l (de gist negeren we).
Met 1 mol = 22.4 liter en het gegeven dat 1 mol suiker 4 mol CO2 genereert kunnen we de act transformeren naar mmol/min.
Het resultaat is de nevenstaande plot.

De grafiek die we nu echter krijgen lijkt niet meer op de LB plot zoals we die verwachten. De hellingshoek loopt opeens anders.

We worden hier geconfronteerd met het verschil tussen model en werkelijkheid. M.a.w. de vergisting van suiker zoals we die hier hebben uitgevoerd kunnen we niet modelleren door alleen maar gebruik te maken van MM kinetiek. Dat is eigenlijk ook wel logisch. We hebben hier niet met een MM reactie te maken maar met een 2 staps proces. De hydrolyse, die ook nog eens 2 verschillende suikers oplevert en de conversie van de suikers naar CO2. I.p.v. een eenvoudige MM reactie hebben we dus te maken met meerdere reacties.

Conclusie:

Opmerkingen:

Literatuur:

Relevante websites:

Minder relevante websites:

Achtergrondinformatie:


Enzymkinetiek

De vergistingsreactie verloopt aangezien er enzymen aangemaakt worden die ervoor zorgen dat de reacties kunnen verlopen.

Een enzym is een eiwit met katalytische eigenschappen, vanwege hun vermogen om specifieke bindingen te activeren (de activeringsenergie wordt verlaagd).

Een enzym heeft naast een eiwitgedeelte (het apo-enzym) vaak nog een andere bouwsteen (de cofactor) nodig voor de katalyserende functie. Het geheel noemt men holo-enzym.

Als cofactor kunnen optreden metaal-ionen (bv Ca2+) of een complex organisch molecuul dat als coenzym functioneert bv NADH

De enzymkinetiek gedraagt zich niet wezenlijk anders dan de normale chemische kinetiek. Vaak heeft men te maken met pseudo-1ste-orde kinetiek (bv als in een 2de orde reactie een de concentraties zeer hoog is en de andere concentratie zeer laag).

In een 1ste orde reactie is de reactiesnelheid evenredig met de concentratie van een reactant.

Voor de reactie: S P

Geldt dan:

dus

Hieruit volgt ook dat de concentratie van P gemakkelijk te berekenen is volgens:

[P] = [S]0 [S] (waarin [S]0 de concentratie van S op tijdstip t=0 is).

Het concentratieverloop is grafisch weergegeven in onderstaande figuur.

Bij een enzymatische bepaling laat men het enzym enige tijd inwerken op het substraat en bepaald men de substraat (S) of product (P) concentratie op verschillende tijdstippen (of continue). De kromme die het verband weergeeft tussen bv de hoeveelheid omgezet substraat (de conversie) en de tijd, noemt men de progress-curve.

We kunnen in de progress-curve zien dat de conversie van S steeds verder van de raaklijn afwijkt. Voor deze afwijking zijn verschillende oorzaken mogelijk:

Om van deze afwijking geen last te hebben moet men dus meten rond t=0.

Het effect van de verschillende enzymconcentraties kan nog duidelijker zichtbaar gemaakt worden door de reactiesnelheid (de omgezette hoeveelheid per tijdseenheid) als functie van de enzymconcentratie uit te zetten. Door het maken van zulk een curve kan men zien dat alleen op t=0 er een lineair verband bestaat tussen de enzymwerking (reactiesnelheid) en enzymhoeveelheid. De juiste reactiesnelheid wordt dus gevonden door op t=0 de raaklijn aan de progress-curve te trekken. Deze reactiesnelheid noemt men de initial velocity (v0).

Er zijn een aantal factoren die van invloed zijn op de reactiesnelheid (initial velocity):

In 1913 ontwikkelden L.Michaelis en M.Menten (MM) een algemene theorie over de werking van enzymen. Briggs en Haldane breidden deze theorie later uit. Deze uitbreiding staat bekend onder de naam steady-state theorie. De MM theorie vormt de basis van de kwantitatieve analyse van alle aspecten van enzymkinetiek en inhibitie en is het best ontwikkeld voor een (1) substraat. De MM theorie gaat er van uit dat een enzym E met het substraat S een enzymsubstraat complex ES vormt dat in een tweede stap uiteenvalt in vrij enzym E en product P (beide reacties zijn reversibel). De MM vergelijking afgeleid volgens de steady-state theorie geeft het mathematische verband tussen de initial velocity, de concentratie S en enkele karakteristieke kenmerken van een enzym.

Reactie:

Symbolen:

Volgens de steady state theorie is de vormingssnelheid van ES gelijk aan de ontledingssnelheid.

De vormingssnelheid van ES: (1)

Hier verwaarlozen we de terugvorming uit P aangezien op t=0 geldt P=0.

De ontledingssnelheid van ES: (2)

(1) = (2) ==>   (3)

Dus: (4)

De initial velocity (reactiesnelheid op t=0) wordt bepaald door de productvorming uit ES:

(5)

(4) in (5) geeft: (6)

De maximale reactiesnelheid (Vmax, S ) wordt dan: (7)

De constante (8) noemt men de Michaelis-Menten constante.

Dus (7) en (8) in (6) geeft de Michaelis-Menten vergelijking:

Michaelis-Menten vergelijking:    of

Consequenties:

  1. s is laag 1 is verwaarloosbaar t.o.v. Km/s
    V0 is evenredig met S (1ste orde).
  2. s is zeer hoog Km/s te verwaarlozen t.o.v. 1
    V0 onafhankelijk van s (0de orde).
  3. V0 = Vmax

    KM is dus gelijk aan de substraatconcentratie die aanleiding geeft tot een initial velocity die gelijk is aan Vmax.

De vorm waarin de MM vergelijking is gegoten is onhandig om uit de experimentele gegevens KM en Vmax te bepalen. Daarom heeft men deze vergelijking getransformeerd naar een lineaire vergelijking (door de reciproke te nemen) waarmee men de Lineweaver-Burk plot kan verkrijgen (die een rechte lijn geeft als men 1/v0 t.o.v. 1/s uitzet).

Helling = KM/Vmax Snijpunt y-as = 1/Vmax Snijpunt x-as = -1/KM


Naam: sacharose 
Triviaalnamen: 
    (kristal)suiker, sucrose,
     rietsuiker, bietsuiker
Formule: C12H22O11
Naam: glucose 
Triviaalnamen: 
    druivesuiker, dextrose, aldohexose
Formule: C6H12O6  
Naam: fructose 
Triviaalnamen: 
    vruchtensuiker, ketohexose
Formule: C6H12O6  
GIST:

De foto laat gistcellen onder de microscoop zien. En gram gist bevat er ongeveer vijftien miljard van.


Gisten zijn eencellige micro-organismen met een grootte van circa 0,005-0,020 mm. Anders dan bacterin hebben gistcellen hun DNA in de celkern opgeborgen; dat hebben zij gemeen met planten, dieren en mensen, waardoor zij ingedeeld zijn bij de eukaryote organismen.

Al vele duizenden jaren spelen gisten een belangrijke rol in het leven van de mens. De oudst bekende vorm van gistgebruik is de spontane omzetting van granen in bier en van druiven in wijn. Daarnaast wordt gist al eeuwen ingezet voor het laten rijzen van brooddeeg; aanvankelijk werd hiervoor de gist gebruikt die overbleef na de biergisting, maar sinds het eind van de negentiende eeuw wordt bakkersgist in toenemende mate gekweekt. Gist wordt ook gegeten. Als vitaminesupplement zijn er gisttabletten en als broodbeleg is er gistpasta(marmiet) te koop. Gist in de vorm van gistextract wordt als hartige smaakstof toegevoegd aan veel voedingsmiddelen, vooral aan soepen en sauzen.

Dankzij het onderzoek van Louis Pasteur (1822-1895) werd duidelijk dat tijdens de wijngisting een toename optrad van het gewicht van de gist die gekoppeld was aan een toename van de hoeveelheid geproduceerde koolstofdioxide. Hieruit concludeerde hij dat er een chemische omzetting plaats vond. Verder onderzoek toonde aan dat gistcellen verantwoordelijk zijn voor de omzetting van suikers in alcohol en koolstofdioxide. Tevens bleken extracten van gistcellen ook andere chemische reacties te katalyseren. De hiervoor verantwoordelijke stoffen werden enzymen Genoemd, wat in het Grieks "in gist" betekent.

Alle tot nu toe bekende gistsoorten zijn in staat om tenminste n suiker, bijvoorbeeld glucose of fructose, te gebruiken als enige bron van koolstof en energie. In aanwezigheid van zuurstof, dus bij de dissimilatie van de gist worden de suikers geheel omgezet in water en koolstofdioxide. Er wordt zoveel energie geproduceerd dat de gistcellen zich snel kunnen vermeerderen. Bij de alcoholische vergisting worden de gistcellen bij afwezigheid van zuurstof gedwongen om de suikers maar gedeeltelijk af te breken om in hun energiebehoefte te voorzien, dit levert echter veel minder energie op, als bijproducten ontstaan alcohol en CO2. Ook bij het broodbakken treedt een alcoholvergisting op.


27-02-2005