vergisting

Alcoholische gisting

Datum: december 2002 - februari 2003

Principe:

Gistingsactiviteit nader bestuderen.

Materiaal:

water
zout
suiker
slang
maatcilinder (50 ml)
stopwatch
slangenklemmetje

fles die afsluitbaar is met een kurk (in mijn geval 50 cl spa flesje)
glazen buisje met kurk dat op de fles past (of rubber afsluitdop en infuusslangetje met holle naald eraan)
bak of schaal
gist

Uitvoering:

Maak 500 ml 10% zoutoplossing en doe deze in het het bakje of schaaltje.
Maal een 10% suikeroplossing door 25 g suiker op te lossen in 250 g water.
Zorg ervoor dat alles goed opgelost is.
Vul de cilinder met de zoutoplossing. Zet hem op zijn kop in de bak met zoutoplossing en noteer de op welke maatstreep het water niveau begint.
Voeg 10 g gist toe aan de suikeroplossing en zorg ervoor dat het gist goed mengt met de suikeroplossing.

Sluit de fles af met de kurk, plaats de slang op het glazen pijpje en zorg ervoor dat het andere uiteinde van de onder de maatcilinder uitkomt zodat alle CO₂ de cilinder inloopt.
Noteer het tijdstip en meet regelmatig hoeveel water er verdrongen is in de maatcilinder.
Als alle water verdrongen is klem de slang dan af en vul de cilinder opnieuw.
Na enkele uren uren schakelen we over op activiteitsmeting, we bepalen dan de tijd benodigd om de maatcilinder te vullen met 50 ml gas.
Indien we de volledige vergistingcurve willen bepalen kan het experiment meerdere (3-5) dagen duren.

Meetresultaten:

EXPERIMENT 1		Temperatuur : 22.5 °C	opstelling
Continue Meeting		Start experiment: 29 december om 16:42 u.
Tijd (hh:mm)	ml verplaatst
00:00 00:15 00:30 00:32 00:39 00:46 00:52 00:58 01:03 01:07 01:12 01:17 01:21 01:26 01:30 01:35 01:39 01:44 01:49	0 4 30 41 87 137 189 244 294 344 394 444 494 544 594 644 694 744 794	Gist oplossing: 10 g Suiker: 26 g Water: 250 g
		Op het moment, na ca. 2 uur toen overgeschakeld zou worden naar activiteitsmetingen moest het experiment afgebroken worden. Door de schuimvorming werd de gistsuspensie door het slangetje geperst.	gasvorming
		Tijdens het experiment hebben we wat gas door een oplossing van kalkwater geleid. Deze werd troebel.	voor	na

EXPERIMENT 2		Temperatuur : 21.5 °C
Continue Meeting		Start experiment: 30 december om 14:34 u.
Tijd (hh:mm)	ml verplaatst
00:00 01:00 02:15 04:46 04:50 05:02	0 0 0 0 10 58	Gist oplossing: 3 g Suiker: 27 g Water: 250 g De gistconcentratie verlaagd om 2 redenen. Het effect hiervan bepalen en hopelijk resulteert dit in minder sterke schuimvorming. Waarschijnlijk een lek op de afsluiting gehad. Daarom initieel geen activiteit gemeten. Ik kon dit zien aan de schuimvorming. Daarom overgegaan op activiteitsmetingen in min/50 ml gas productie. Wederom werd dit experiment geplaagd door sterke schuimvorming na ca. 6 uur.
Activiteitsmeting
Tijd (hh:mm)	min/50 ml CO2
05:02-05:15 06:04-06:19 19:33-20:35 31:00-32:12	13 15 62 72

EXPERIMENT 3		Temperatuur : 21.5 °C
Continue Meeting		Start experiment: 1 januari om 13:55 u.
Tijd (hh:mm)	ml verplaatst
00:00 01:00 01:30 01:46 02:10 02:28 02:44 02:59 03:13 03:26 03:39 03:52 04:04 04:18	0 18 33 50 102 152 202 252 302 352 402 452 502 554	Gist oplossing: 3 g Suiker: 12 g Water: 200 g De suikerconcentratie verlaagd om het effect hiervan bepalen. Ik verwacht ook minder CO2 productie. Na 15 min. de eerste CO₂ bellen. Ook nu is na 6-7 uur de schuimvorming dermate groot geworden dat men niet zo goed kan meten omdat het slangetje zich dan met gist vult.
Activiteitsmeting
Tijd (hh:mm)	min/50 ml CO2
04:58-05:12 19:00-20:14 22:55-24:07 27:23-28:15 29:37-30:18 43:38-51:20	14 74 72 100 (26 ml) 89 (23 ml) 513 (45 ml)

EXPERIMENT 4		Temperatuur : 21.2 °C
Continue Meeting		Start experiment: 4 januari om 18:30 u.
Tijd (hh:mm)	ml verplaatst
00:00 00:20 00:45 00:52 01:07	0 8 (?) 19 (?) 30 (?) 50 (?)	Gist oplossing: 3 g Suiker: 25 g Water: 200 g (?) vermoedde een lek, veel geschud en geprobeerd.
Activiteitsmeting
Tijd (hh:mm)	min/50 ml CO2
02:07-02:26 02:28-02:44 02:45-03:00 03:03-03:18 03:18-03:33 03:34-03:48 04:48-05:05 16:24-17:36 17:57-18:52 23:27-25:32	19 16 15 15 15 15 17 68 (53ml) 55 (35 ml)

Na 4 experimenten was de gist op.

Discussie:

In de gist aanwezige enzymen kunnen bepaalde suikers vergisten tot ethanol. Bij de gisting van gewone suiker heeft men te maken met een proces dat opgebouwd is uit twee stappen:

1. De suiker wordt gehydrolyseerd door de in de gist aanwezige enzymen tot glucose en fructose.

Reactie : C₁₂H₂₂O₁₁ + H₂O -----> 2C₆H₁₂O₆ (glucose/fructose)

2. Glucose en fructose worden dan door de in de gist aanwezige enzymen omgezet in ethanol en CO₂.

Reactie : C₆H₁₂O₆ -----> 2C₂H₅OH + 2CO₂

De netto reactie wordt dan: C₁₂H₂₂O₁₁ + H₂O -----> 4C₂H₅OH + 4CO₂

Dat inderdaad CO2 gevormd wordt hebben we aangetoond door wat gas door een kalkwater oplossing te leiden:
Waarneming : De oplossing van kalkwater wordt troebel
Reactie : CO₂ (g) + Ca(OH)₂ --> CaCO₃ (s) + H₂O

Een volledige vergistingcurve, waarbij de activiteit op de y-as wordt geplot t.o.v. de tijd zou eruit zien zoals in de figuur hiernaast.

Helaas hebben we niet genoeg datapunten verzameld tijdens een van de experimenten om een dergelijke curve te kunnen samenstellen.

Om relevante conclusies te kunnen trekken is dit echter ook niet nodig, de initiële activiteit is daarvoor voldoende, zoals we laten zien bij de behandeling van de enzymkinetiek (zie achtergrondinformatie).

Vertalen we de meetresultaten in grafieken dan krijgen we het hieronderstaande resultaat.

CO2 produktie

activiteit

Dit zijn echter min of meer rechtlijnig afgeleide grafieken. We willen echter een Lineweaver-Burk plot maken
(Zie Achtergrondinformatie voor meer details over deze plot).

Vatten we alle resultaten samen in een tabel:

Lineweaver - Burke plot

s	act	e	1/s	1/act
%	min/50 ml CO2	%	1/%	50 ml CO2/min
5.6	13	1.4	0.1786	0.0769
9.1	4.5	3.5	0.1099	0.2222
9.6	14	1.1	0.1042	0.0714
11	15	1.3	0.0909	0.0667

De resultaten van EXP 1 zijn niet bruikbaar voor de LB plot aangezien de gist concentratie sterk verschillend is t.o.v. de andere experimenten. We kunnen uit dit experiment, indien we het vergelijken met de andere, echter wel concluderen dat een toename van de enzymconcentratie de reactie versneld.

Plotten we de zo verkregen waarden in een LB plot dan krijgen we nevenstaand resultaat met act in min/50 mol CO₂ en s in %.

Met Snijpunt y-as = 1/V_maxen Snijpunt x-as = -1/K_MKrijgen we:
K_M = 2.2 (in % oftewel g/100g)
V_max = 17.8 (min/50 ml CO₂)

Normaliter worden dergelijke getallen echter in mol/l en mol/min uitgedrukt.

We kunnen de getallen hierboven echter (grofstoffelijk) omrekenen:
De dichtheid van de oplossing (1.03 g/ml) en de molmassa van de suiker (342 g/mol) gebruiken we om de concentratie van de oplossing uit te rekenen in mol/l (de gist negeren we).
Met 1 mol = 22.4 liter en het gegeven dat 1 mol suiker 4 mol CO₂ genereert kunnen we de act transformeren naar mmol/min.
Het resultaat is de nevenstaande plot.

De grafiek die we nu echter krijgen lijkt niet meer op de LB plot zoals we die verwachten. De hellingshoek loopt opeens anders.

We worden hier geconfronteerd met het verschil tussen model en werkelijkheid. M.a.w. de vergisting van suiker zoals we die hier hebben uitgevoerd kunnen we niet modelleren door alleen maar gebruik te maken van MM kinetiek. Dat is eigenlijk ook wel logisch. We hebben hier niet met een MM reactie te maken maar met een 2 staps proces. De hydrolyse, die ook nog eens 2 verschillende suikers oplevert en de conversie van de suikers naar CO_2. I.p.v. een eenvoudige MM reactie hebben we dus te maken met meerdere reacties.

Conclusie:

In het begin van de gisting loopt de grafiek niet lineair aangezien:
1. de gisting nog op gang moet komen (enzymvorming)
2. er CO₂ oplost in de vloeistof
De activiteit van de gisting neem in de loop van het experiment af.
Een toename van de gistconcentratie zorgt ervoor dat de activiteit toeneemt.
De alcoholische vergisting zoals hier bestudeerd voldoet niet aan de MM kinetiek.

Opmerkingen:

We gebruiken een zoutoplossing i.p.v. water om het oplossen van CO₂ in water tegen te gaan.
Vet de afsluitingen in met vaseline of siliconenvet om het geheel zo gasdicht mogelijk te maken.
Zoals aan de foto te zien is heb ik de proefopstelling enigszins aangepast aan de materialen die ik bij de hand had, nl. een infuus slangetje met holle naald en een rubberen afsluitdop.
Met een flexibel slangetje kan men na het opnieuw vullen en plaatsen van de maatcilinder alle lucht eruit zuigen zodat deze daadwerkelijk op 0 staat.
Het is beter om de oplossing te roeren gedurende het experiment. Het gebruik van deze flesjes maakt dat echter niet mogelijk.
Dit is echt een experiment waarvoor geldt: al doende leert men. Zorg dus voor voldoende gist, suiker en tijd om het meerdere malen te kunnen doen. Op deze manier kunnen we dan de invloed van gist en suikerconcentratie beter onderzoeken. Ook zouden we met een iets andere opstelling de invloed van temperatuur en pH kunnen onderzoeken.
Het zou interessant zijn om te onderzoeken of glucose of fructose wel aan de MM kinetiek voldoet.

Literatuur:

F. Roelandse; 'Alcoholische gisting'; DJO; 1975 5; blz. 128-130.
A. Meesters et al; 'practicum biologie'; Stichting Onderwijs Orientatie; 1970; ISBN 9023140206; blz.38-40.
Cyril Bibby; 'Simple experiments in biology'; Heinemann; 1956 (1969); p. 122.
Cyril Bibby; 'Biologie als hobby'; Ruys; 19??; p. 169.
David Burnie; De Natuur ontdekken; Davidsfonds/Infodok; 2000; ISBN 9065655387; blz. 67.
Judith Hahn; De Jonge Onderzoeker; Het Spectrum; 1980; ISBN 9027492689; blz. 127.
H.Scott Fogler; 'Elements of Chemical Reaction Engineering'; Prentice-Hall; 1986; ISBN 013263666; blz. 328-337.
Allan Jones, Rob Reed and Jonathan Weyers; 'Practical Skills in Biology'; Addison Wesley; 1994; ISBN 0582066999; blz. 149-152, 159-164.
Lubert Stryer; 'Biochemistry'; Freeman; 1975,1981, 2nd Ed.; ISBN 0716712261; p. 103-134.

Relevante websites:

Wikipedia - Vergisting

Minder relevante websites:

Sugar Engineers' Library

Achtergrondinformatie:

Enzymkinetiek

De vergistingsreactie verloopt aangezien er enzymen aangemaakt worden die ervoor zorgen dat de reacties kunnen verlopen.

Een enzym is een eiwit met katalytische eigenschappen, vanwege hun vermogen om specifieke bindingen te activeren (de activeringsenergie wordt verlaagd).

Een enzym heeft naast een eiwitgedeelte (het apo-enzym) vaak nog een andere bouwsteen (de cofactor) nodig voor de katalyserende functie. Het geheel noemt men holo-enzym.

Als cofactor kunnen optreden metaal-ionen (bv Ca²⁺) of een complex organisch molecuul dat als coenzym functioneert bv NADH

De enzymkinetiek gedraagt zich niet wezenlijk anders dan de normale chemische kinetiek. Vaak heeft men te maken met pseudo-1^ste-orde kinetiek (bv als in een 2^de orde reactie een de concentraties zeer hoog is en de andere concentratie zeer laag).

In een 1^ste orde reactie is de reactiesnelheid evenredig met de concentratie van een reactant.

Voor de reactie: S à P

Geldt dan:

dus

Hieruit volgt ook dat de concentratie van P gemakkelijk te berekenen is volgens:

[P] = [S]₀ – [S] (waarin [S]₀de concentratie van S op tijdstip t=0 is).

Het concentratieverloop is grafisch weergegeven in onderstaande figuur.

Bij een enzymatische bepaling laat men het enzym enige tijd inwerken op het substraat en bepaald men de substraat (S) of product (P) concentratie op verschillende tijdstippen (of continue). De kromme die het verband weergeeft tussen bv de hoeveelheid omgezet substraat (de conversie) en de tijd, noemt men de progress-curve.

We kunnen in de progress-curve zien dat de conversie van S steeds verder van de raaklijn afwijkt. Voor deze afwijking zijn verschillende oorzaken mogelijk:

De concentratie van S neemt af en de reactie verloopt volgens de 1^ste orde kinetiek
De concentratie van P neemt toe, zodat bij een reversibele reactie, de omgekeerde reactie steeds sneller loopt.
Het gevormde P remt soms de reactie (negatieve feedback).
Het enzym wordt minder actief door denaturatie.

Om van deze afwijking geen last te hebben moet men dus meten rond t=0.

Het effect van de verschillende enzymconcentraties kan nog duidelijker zichtbaar gemaakt worden door de reactiesnelheid (de omgezette hoeveelheid per tijdseenheid) als functie van de enzymconcentratie uit te zetten. Door het maken van zulk een curve kan men zien dat alleen op t=0 er een lineair verband bestaat tussen de enzymwerking (reactiesnelheid) en enzymhoeveelheid. De juiste reactiesnelheid wordt dus gevonden door op t=0 de raaklijn aan de progress-curve te trekken. Deze reactiesnelheid noemt men de initial velocity (v₀).

Er zijn een aantal factoren die van invloed zijn op de reactiesnelheid (initial velocity):

de enzymconcentratie [E]
de substraatconcentratie [S]
de pH
de temperatuur
remmers (inhibitoren) en aktivatoren

In 1913 ontwikkelden L.Michaelis en M.Menten (MM) een algemene theorie over de werking van enzymen. Briggs en Haldane breidden deze theorie later uit. Deze uitbreiding staat bekend onder de naam steady-state theorie. De MM theorie vormt de basis van de kwantitatieve analyse van alle aspecten van enzymkinetiek en inhibitie en is het best ontwikkeld voor een (1) substraat. De MM theorie gaat er van uit dat een enzym E met het substraat S een enzymsubstraat complex ES vormt dat in een tweede stap uiteenvalt in vrij enzym E en product P (beide reacties zijn reversibel). De MM vergelijking afgeleid volgens de steady-state theorie geeft het mathematische verband tussen de initial velocity, de concentratie S en enkele karakteristieke kenmerken van een enzym.

Reactie:

Symbolen:

e = totale concentratie enzym
p = concentratie ES ( dus e-p = concentratie vrije enzym !)
s = concentratie vrije substraat
v_o = initial velocity (beginsnelheid)
k = reactieconstante

Volgens de steady state theorie is de vormingssnelheid van ES gelijk aan de ontledingssnelheid.

De vormingssnelheid van ES: (1)

Hier verwaarlozen we de terugvorming uit P aangezien op t=0 geldt P=0.

De ontledingssnelheid van ES: (2)

(1) = (2) ==> (3)

Dus: (4)

De initial velocity (reactiesnelheid op t=0) wordt bepaald door de productvorming uit ES:

(5)

(4) in (5) geeft: (6)

De maximale reactiesnelheid (V_max, S à ) wordt dan: (7)

De constante (8) noemt men de Michaelis-Menten constante.

Dus (7) en (8) in (6) geeft de Michaelis-Menten vergelijking:

Michaelis-Menten vergelijking:

Consequenties:

s is laag à 1 is verwaarloosbaar t.o.v. Km/s à
V₀is evenredig met S (1^ste orde).
s is zeer hoog à Km/s te verwaarlozen t.o.v. 1 à
V₀ onafhankelijk van s (0^de orde).
V₀ = ½ V_max à
K_M is dus gelijk aan de substraatconcentratie die aanleiding geeft tot een initial velocity die gelijk is aan ½ V_max.

De vorm waarin de MM vergelijking is gegoten is onhandig om uit de experimentele gegevens K_M en V_max te bepalen. Daarom heeft men deze vergelijking getransformeerd naar een lineaire vergelijking (door de reciproke te nemen) waarmee men de Lineweaver-Burk plot kan verkrijgen (die een rechte lijn geeft als men 1/v₀ t.o.v. 1/s uitzet).

Helling = K_M/V_maxSnijpunt y-as = 1/V_maxSnijpunt x-as = -1/K_M

Naam: sacharose Triviaalnamen: (kristal)suiker, sucrose, rietsuiker, bietsuiker Formule: C₁₂H₂₂O₁₁
Naam: glucose Triviaalnamen: druivesuiker, dextrose, aldohexose Formule: C₆H₁₂O₆
Naam: fructose Triviaalnamen: vruchtensuiker, ketohexose Formule: C₆H₁₂O₆
GIST: De foto laat gistcellen onder de microscoop zien. Eén gram gist bevat er ongeveer vijftien miljard van.

Gisten zijn eencellige micro-organismen met een grootte van circa 0,005-0,020 mm. Anders dan bacteriën hebben gistcellen hun DNA in de celkern opgeborgen; dat hebben zij gemeen met planten, dieren en mensen, waardoor zij ingedeeld zijn bij de eukaryote organismen.

Al vele duizenden jaren spelen gisten een belangrijke rol in het leven van de mens. De oudst bekende vorm van gistgebruik is de spontane omzetting van granen in bier en van druiven in wijn. Daarnaast wordt gist al eeuwen ingezet voor het laten rijzen van brooddeeg; aanvankelijk werd hiervoor de gist gebruikt die overbleef na de biergisting, maar sinds het eind van de negentiende eeuw wordt bakkersgist in toenemende mate gekweekt. Gist wordt ook gegeten. Als vitaminesupplement zijn er gisttabletten en als broodbeleg is er gistpasta(marmiet) te koop. Gist in de vorm van gistextract wordt als hartige smaakstof toegevoegd aan veel voedingsmiddelen, vooral aan soepen en sauzen.

Dankzij het onderzoek van Louis Pasteur (1822-1895) werd duidelijk dat tijdens de wijngisting een toename optrad van het gewicht van de gist die gekoppeld was aan een toename van de hoeveelheid geproduceerde koolstofdioxide. Hieruit concludeerde hij dat er een chemische omzetting plaats vond. Verder onderzoek toonde aan dat gistcellen verantwoordelijk zijn voor de omzetting van suikers in alcohol en koolstofdioxide. Tevens bleken extracten van gistcellen ook andere chemische reacties te katalyseren. De hiervoor verantwoordelijke stoffen werden enzymen Genoemd, wat in het Grieks "in gist" betekent.

Alle tot nu toe bekende gistsoorten zijn in staat om tenminste één suiker, bijvoorbeeld glucose of fructose, te gebruiken als enige bron van koolstof en energie. In aanwezigheid van zuurstof, dus bij de dissimilatie van de gist worden de suikers geheel omgezet in water en koolstofdioxide. Er wordt zoveel energie geproduceerd dat de gistcellen zich snel kunnen vermeerderen. Bij de alcoholische vergisting worden de gistcellen bij afwezigheid van zuurstof gedwongen om de suikers maar gedeeltelijk af te breken om in hun energiebehoefte te voorzien, dit levert echter veel minder energie op, als bijproducten ontstaan alcohol en CO₂. Ook bij het broodbakken treedt een alcoholvergisting op.

27-02-2005